家族性高胆固醇血症的研究进展

　　心血管疾病是目前世界上最主要的死亡原因，像大多数的慢性疾病一样，是基因和环境因素共同作用的结果。家族性高胆固醇血症（Familial hypercholesterolemia, FH）是最典型的常染色体显性遗传性单基因疾病，是低密度脂蛋白受体（Low density lipoprotein receptor, LDLR）基因突变导致的。在55岁之前早发的心血管事件中，其中5%是杂合子的家族性高胆固醇血症患者，而50%的家族性高胆固醇血症患者在60岁之前死于心肌梗死[1]。大约在150年前就曾有关此症的描述。1836年首次有人报道了黄色瘤, 1873年Fagge发现黄色瘤有家族聚集性, 1914年Schidt首次对黄色瘤患者进行血浆胆固醇的测定。此后, 人们开始将黄色瘤与高胆固醇血症联系在一起。在本世纪30年代后期, Miller等将黄色瘤和冠心病视为一体。Thannhauser和Miller首先描述了该病的临床表现, 多年来, 仅根据临床特征进行诊断。但Leonard发现仅根据血浆胆固醇水平尚不能确诊该病,因为大部分患该病的儿童和脐带中胆固醇并未增高到可诊断水平, 甚至到生命的中晚期才见增高。1981年,Keller采用培养的皮肤成纤维细胞, 测定标记的LDL与其受体结合情况, 试图建立FH的实验室诊断方法。但是, 后来发现正常人与杂合子患者的测定值之间有较明显的交叉重叠现象, 且该方法在技术上也较为困难。1982年, sneider成功地纯化了牛肾上腺LDL受体基因。1984年, Yamamoto成功地分离并克隆了5.3kb受体基因的全长cDNA, 并制成了探针, 为在DNA水平上分析FH的基因突变开辟了途径。与此同时,Khachadurian对弄清FH的临床和遗传特点进行了大量的研究, 他的出色工作为后来Goldstein和Brown发现LDL受体并对FH的遗传和代谢基础进行深入细致的研究奠定了良好的基础。 国内于1985年首次报道了纯合子型FH, 并对该病进行了较为系统的有关诊断和治疗的研究。目前的研究发现，杂合子FH的发病率为1/500，纯合子的发病率为百万分之一，中国人的FH发病率略高于此。而在某些国家如法裔加拿大人、芬兰人、欧洲血统的南非人和黎巴嫩人由于“奠基基因”效应，FH的发病率可高达1/67[2]。

　　一.临床表现：①高胆固醇血症：纯合子FH患者是由于从其父母各遗传获得一个异常的LDLR基因，在患者体内没有或很少有功能性的LDL受体，因而造成患者血浆中胆固醇水平高出正常人6～8倍；②特征性黄色瘤：主要位于足跟、肘、膝、手背的肌腱，足部、眼睑内眦等处。纯合子在儿童时期出现，而杂合子多在30－60岁出现，为胆固醇积聚于间质间隙和组织巨噬细胞内之故；③早发的心血管疾病：纯合子FH患者较早出现主动脉粥样硬化，多在10余岁时就出现冠心病的临床症状和体征，如得不到有效的治疗，这些病人很难活到30岁，在男性杂合子FH患者30－40岁便可能患有冠心病，而女性杂合子FH患者冠心病的发病年龄较男性患者晚10年左右；④阳性家族史：目前已知，其遗传方式主要是常染色体显性遗传[3]。临床诊断FH的标准为：成人胆固醇>7.8mmol/L；16岁以下儿童胆固醇>6.7mmol/L或成人LDL-C>4.9mmol/L，患者或亲属有腱黄色瘤者诊断为FH，其中胆固醇>16mmol/L，患者有腱黄色瘤者诊断为纯合子FH，未达纯合子标准者诊断为杂合子FH[4]。

　　二．LDLR基因的结构及其突变

　　1. LDLR的结构功能

　　1973年Brown和Goldstein研究FH时发现LDL-R 蛋白质缺陷[5]，1985年Lindgre通过原位杂交技术发现了LDLR 基因在染色体上的定位。LDLR基因定位于染色体19p13.1–13.3，长约45kb大小，包含了18个外显子和17个内含子，编码一个含有839个氨基酸的成熟蛋白质―LDLR，其分子量约为16万[6]。LDLR包含五个不同的功能域（见图1）：⑴ 半胱氨酸富集区（Cysteine－ rich region），主要功能是结合配体，故又称配体结合域（Ligand binding structure domain）；⑵ 表皮生长因子前体结构域（EGF precursor structure domain）大约由400个氨基酸残基组成，其结构与EGF前体有33％的同源，有5个重复序列；⑶含O－连接糖链结构域（O－linked structure domain）由58个氨基酸残基，外于膜外；⑷跨膜结构域（Memberrance spanning structure domain），由22个氨基酸残基组成；⑸胞液结构域（Cytoplasmic structure domain），位于受体的C－末端，深埋于胞浆中[7]。

　　2．LDL在细胞的代谢过程

　　LDL受体存在于哺乳动物和人体几乎所有的细胞如肝脏、动脉平滑肌、血管内皮细胞和白细胞等表面，其中70%的受体成族聚集在仅占整个细胞表面约2%的节段。LDLR能特异性结合载脂蛋白B100和E的脂蛋白进入细胞内进行代谢，LDLR可以清除血中2/3的LDL[8]（其代谢途径参见图2）。细胞内新合成的LDL受体前体由860个氨基酸残基组成, 分子量120kD, 在由内质网向尔基体转运中, 切去由21个氨基酸残基组成的信号肽, 加上18个O-连接和2个N-连接的寡糖链, 成熟LDL受体分子量160kD, 于合成后约45分钟时到达细胞表面, 并丛集于由细胞内陷形成的特殊有被小窝(coated pit)内。LDL受体与LDL结合后, 在有被小窝内吞成内体, 多个内体相互融合为不规则的大泡, 大泡膜上质子泵的活性使泡内pH降至6.5以下, 在此酸性条件下, LDL受体与LDL分离, 前者回到细胞表面重新起作用, 后者则进入溶酶体, 在多种水解酶作用下分解代谢。

　　3．在诊断FH时首先要排除家族性载脂蛋白B－100缺陷（Familial defective apoliprotein B－100，FDB）

　　FDB也是一种常染色体显性遗传性疾病，其患者的临床和生化表现与杂合子FH很相似，但FDB患者的血浆LDL –C水平只是轻度升高。而且与LDL－R基因突变多样性不同的是：FDB通常是ApoB－100基因的3500位密码子的精氨酸（arginine）被谷氨酰胺（glutamine）代替[9]。ApoB－100基因编码的ApoB－100是与LDL结合的唯一蛋白，通过ApoB－100介导，LDL才与LDLR结合。所以ApoB－100基因突变导致的ApoB－100功能改变从而降低了LDL与LDLR的亲和力，最终导致血浆LDL水平的升高。目前国际上常采用的检测ApoB100基因突变方法是等位基因杂交法或是PCR介导的定位突变法。 PCR介导的定位突变法是对PCR引物进行荧光染色，PCR产物经限制性内切酶MspI消化，DNA 片断电泳后，用荧光纤维镜观察并可对DNA的量进行定量[10]。

　　4．检测LDL－R基因突变的生物学方法

　　HK Jense等提出对FH患者进行基因诊断的技术路线：（见图3）[11]。在某些地区社会和地理因素导致人群从遗传学角度是分离的，因此由于“奠基基因”效应，一种或几种突变占了大多数。在这样的人群中，基因筛选和基因诊断较为简单。而在大多数地区中，不存在“奠基基因”效应，家系分析对于早期发现FH患者起了很大作用。最初使用的低密度脂蛋白受体的快速诊断方法有Southern印迹法，电磁脉冲凝胶法(pulse field gelectrophoresis)，原位荧光杂交法(fluorescence in situ hybridization)和逆转录-多聚酶链杂交法(polymerase chain reaction)，但这些技术有一定的局限性[12]。 近几年新的检测方法层出不穷，利用这些方法检测到了许多低密度脂蛋白受体基因新突变，已被广泛应用于研究和临床。这些方法包括：⑴聚合酶链反应－单链构象多态性分析（Polymerase chain reaction－single strain conformation polymorphism，PCR－SSCP）是一种DNA单链凝胶电泳技术，扩增的产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰凝胶电泳，靶DNA中会因碱基置换、碱基插入或缺失等变化，造成迁移率变化而出现泳动变化，据报道SSCP可明确80%～90%LDLR基因的点突变，并能检测出单链DNA中绝大多数序列的变化，尤其是150～250核苷长度的片断，从而可对先证者家系的成员明确诊断，并对其后代早期诊断，提供咨询和指导及用于排除诊断[13]。⑵ 变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)：是双链DNA片段通过含有浓度递增的变性剂进行的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。⑶ 长距离多聚酶链反应（long-distance PCR）：可以用来发现较大的重排，而且可以用来发现一些特殊的或者在某些国家或地区常见的突变类型[14]。⑷ 通用引物定量荧光多重多聚酶链反应（universal primer quantitative fluorescent multiplex-PCR,UPQFM-PCR）。⑸ 突变体等位基因特异扩增技术（mutant allele-specific amplification, MASA）。此外，还有一些其他新的检测方法如利用微卫星和基因内单倍体型及错位匹配PCR-RFLP等。

　　5．LDLR基因突变

　　目前认为FH是由LDLR基因突变引起，LDLR基因各种突变均可导致FH。今年来对各个国家和地区的家族性高胆固醇血症患者进行分子生物学检测，发现了越来越多的LDLR的突变类型。而UMD－LDLR数据库是一个用户化的软件，现已发展为一个包含所有突变类型的数据库，并能将突变在核苷酸和蛋白质水平上进行分析。2002年9月UMD－LDLR数据库采纳了人类基因突变命名工作组的建议对数据库进行了更新。最近的UMD－LDLR数据库共包含了920种突变类型，其中490种是新增加的突变。① 在cDNA水平：共发现了840种突变类型，而其中约90%是点突变，大致情况是：610种是碱基置换突变、121种是移码突变、53种是整码突变。② 在基因组水平：还含有57种内含子的碱基置换突变，其中37%影响同源剪接序列(+1, +2, –1, and –2)。③ 在蛋白质水平：有507种错义突变，103种无义突变，139种是终止密码突变，35种是氨基酸框移突变。以下是列举部分列入UMD－LDLR中新的突变（见下表）[15]。