抗乙酰胆碱受体抗体主要为IgC型(以IgCl、IGC.2亚类为主,IgC.亚类次之),可检测到IgM型。不同类型的MG病人血清抗AchR抗体具有不同性质。抗AchR抗体的检测方法最先使用的是放射免疫,以后,为避免使用核素,各种酶联免疫法应运而生。这些检测方法中都要应用。·银环蛇毒素(a-bungarotoxin,a-BT):a-BT是从银环蛇毒液中提取的一种肽类,分子量为8kD左右。它能高度选择性与AchR结合,这种结合几乎是不可逆的。如用ELISA法,可用ct-BT预先包被固相载体,然后利用其特异性吸附加入的AchR,再测定待测血清中的抗AchR抗体。ELISA法简便易行,便于推广,故将其介绍如下。
1.试剂 ①a-BT:可购得商品;②AchR:取人骨骼肌200—250g,用生理盐水洗净,加入湿重2倍量的缓冲液,高速匀浆90s后20 000Xg离心30rain。除去上清(血液、脂质),加入湿重2倍量的缓冲液,再次匀浆。向其中加入TritonX-100至最终浓度为2%,4℃搅拌过夜。100 000Xg离心1h,上清即为AchR。也可购买商品;③HRP标记的抗人IgC。
2.操作步骤
(1)用包被液将ct-BT稀释为最适浓度(用方阵滴定法选出),包被聚苯乙烯反应板,每孔200pL(含ct-BT约为2.5pmol/L)。4℃过夜后用洗涤液洗3次,每次3min(以下同)。
(2)将AchR用稀释液适当稀释,加至包被孔中,每孔200btL(0.2pm01),37~C1h。同上洗涤。
(3)力[1X适当稀释的待测血清,每孔200gL,37℃30min。同上洗涤。
(4)加入最适工作浓度的HRP标记抗人IgC,37℃30rain。同上洗涤。
(5)加入底物溶液(OPD-H202)每孔200L,37℃ 30min,mol/LH2S04终止反应。
3.结果观察 于酶标仪上测492nm吸光度。以阳性混合血清作为标准血清,制备标准曲线。待测血清中抗AchR抗体含量,可根据吸光度从标准曲线上换算。
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ELISA法:0.09~0.148或阴性。(注:具体参考值请根据各实验室而定。)
阳性(>0.169):重症肌无力。另外,检出率在合并胸腺瘤的眼肌型、全身型或无胸腺瘤的全身型重症肌无力病人最高,阳性率达70%以上。