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生殖器疱疹鉴别诊断_如何诊断生殖器疱疹

  诊断

  HSV感染的诊断要依据病史、临床表现和实验室检查结果而定。有不洁性交史,而且在生殖器部位出现皮肤红斑和原发性水疱,易复发等不难诊断。必要时可作疱液涂片,培养、接种、免疫荧光检查。血清免疫抗体测定等,均有助于诊断和确定病毒类型。

  一、细胞学方法

  对皮损刮片做Wright-Gemsa (Tzanck试验)或Papanicolaou染色,可检出HSV感染特征的巨细胞包函体,但不能区别HSV感染或水痘 — 带状疱疹病毒感染,敏感性仅为病毒分离的60%。

  二、培养法

  从水疱底部取材做组织培养分离病毒,为目前较敏感、最特异的检查方法,需5-10天,因其技术条件要求高,价格昂贵,不能普遍使用。

  三、抗体检测

  目前最广泛的是HSV-2抗体检测,如蛋白印迹法也可用gD2作抗原检测HSV-2抗体,具有敏感性,且能区分HSV-1和HSV-2的优点。

  四、基因诊断

  (一)用PCR分型检测单纯疱疹病毒

  PCR是一种敏感性高,特异性强的快速检测方法,标本中含有1fg HSV-DNA就可以检出,其在HSV感染的诊断研究中发展较快,且分型检测HSV是发展的趋势。

  1、标本采集和处理

  (1)标本采集

  ①脑脊液:直接无菌采取患者0.5ml脑脊液标本于无菌试管送检。如肉眼可见血色,应离心取上清。

  ②羊水及婴儿血清: 同上,应避免溶血。

  ③脑组织: 脑组织尸检、活检标本, 加1ml PBS标本缓冲液研磨后,待检。

  ④眼及皮肤病灶分泌物:用预测(半干)棉拭子直接取患处分泌物, 置1ml PBS标本缓冲液中送检。

  ⑤生殖器(宫颈、阴道、外阴、阴茎)标本:先用消毒棉拭子擦去病变部位表面粘液、污垢,再用预潮棉拭子用力擦拭患处分泌物,置1ml PBS标本缓冲液中送检。

  (2)标本处理

  ①预处理:所有液体标本均可直接进行模板制备;可以取100μl标本液,离心5000 r/ min×5min后,去上清,取沉淀物进行模板制备。

  ②模板制备:a: 蛋白酶K消化裂解法:沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液,55℃1 h后,煮沸10 min,离心5000 r/ min×5min,收集上清。 b: 水煮法:沉淀物加100μl蒸馏水,摇均水煮20 min,离心5000 r/ min×5min收集上清。c: 1%Triton X-100裂解法:取采集的标本液100μl,加入1μl Triton X-100,水煮20 min,5000 r/ min×5min,收集上清。d: 5%NP-40裂解法:取采集的标本液100μl,加5μl NP-40,水煮20 min ,5000 r/ min×5min收集上清。e: 如标本溶血严重经上述裂解处理后,再加等体积酚-氯仿抽提、冷乙醇沉淀DNA,加10μl DW溶解待检。

  2、PCR扩增

  (1)引物设计。以HSV DNA聚合酶的高保守区为检测靶序列以确保特异性。设计3个引物,一个上游共同性引物,DNAP5(5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′):二个下游特异性引物,DNAP3-1(5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′ )和DNAP3-2(5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′),可以分别扩增出HSV-1 469bp DNA片段(1981~2359)、HSV-2 391bp片段(1561~1953):从二型PCR扩增产物中设计了一个不分型的特异性探针HSVP3 5 'GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘)。

  (2)PCR实验体系。取模板10μl: DNAP5 0.5(0.2μmol/L):DNAP3-1 0.5μl (0.2μmol/L):DNAP3-2 0.5μl (0.2μmol/L):4×dNTP 8μl(4×200μmol/L):10×dNTP 8μl(4×200μmol/L);10×缓冲液10μl:DMSO 4μl;加DW 65.5μl; 石蜡油 30μl.。

  水煮(96℃~100℃)7min

  加TaqDNA聚合酶1μl;(2.5U)

  72℃4 min

  ↓

  95℃40s

  ↓

  65℃60s → 72℃70s

  ↓  33个循环

  70℃4 min

  3.扩增产物的检测和分析

  (1)琼脂糖凝胶电泳染色法:取扩增产物20μl加样品缓冲液4μl混匀后,点样于2%琼脂糖凝胶板,70V电泳15~20min,溴化乙锭(EB)染色5min,于紫外灯下观察结果在溴酚蓝后面有一条或二条亮红带为阳性结果,HSV-2带在前,HSV-1带在后,无带则为阴性结果。

  (2))XhoI酶谱法:取HSV-1型PCR产物50μl加XhoI50U,37℃1h后,置3%琼脂糖凝胶中,70V电泳15~20min,可产生46bp片段带(引物后面);与正常PCR产物比较,XhoI酶切后的大片段电泳位置前移。

  (3)Southern印迹法:PCR产物20μl经电泳分离后,用变性液处理60min,再用中和液处理90 min,转移至硝酸纤维素膜上:80℃烤膜2 h,42℃预杂交(杂交液中)30 min, 加入32p标记HSVP3探针后,42℃杂交过夜;次日用1%SDS/ PBS pH7.2, 42℃洗15min, 0.5% SDS/PBS pH7.2, 42℃洗15min; 膜置X线暗盒内放射性自显影12~15h, 显影为阳性, 不显影为阴性。

  (二)套式PCR

  套式PCR(nested primers-polymerase chain reaction,NP-PCR)是通过“外侧”、“内侧”两对引物,即一对扩增较大DNA片段的“外侧”引物和一对位于扩增产物中再扩增小片段的“内侧”引物,这样两次连续放大可以提高PCR检测的灵敏度,保证产物的特异性。但该方法不能分型,能100%检出HSV-1,50%检出HSV-2,应改进分型检测HSV,更好地在临床应用和基础研究中推广应用。

  1、标本处理:

  (1)标本采集同上

  (2)DNA 制备:①脑脊液:取100μlCSF 水煮15min,加入250μl无水乙醇,放-30℃10 min;离心10000g30 min,去上清,30℃干燥后,加入10μl DW; ②脑组织细胞:取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液,56℃作用1h,水煮10 min;取上清加入等体积酚一氯仿(V/V),轻摇10 min,离心10000r/ min×10 min;取水相,加入250μl DW溶解。

  2、PCR扩增

  (1)引物设计:选择HSV1糖蛋白D基因为检测靶基因。

  NP-PCR 的引物和探针序列

  “外”引物

  BJHSV1.1ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA19-43

  BJHGV1.2CATACCGGAACGCACCACACAA218-239

  “内引物”

  BJHSV1.3CCATACCGACCACACCGACGA51-79

  BJHSV1.4CGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA166-188

  探针

  BJHSV-1PROTACGAGGAGGAGCTGTATAACAAAGTCTGT96-125

  (2) PCR实验体系和程序: 反应体积为50μl;模板10μl;BJHSV1.1 0.5μl(0.2pmol/L); BJHSV1.2 0.5μl(0.2pmol/L); 10×缓冲液5μl; 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L);DW 27μl; 石蜡油30μl。循环参数为95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循环20次, 取其扩增产物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反应体系中进行套式扩增, 先95℃变性2min,循环参数为95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循环30次后,72℃延伸5 min;。

  (3) 扩增产物分析:

  ① 琼脂糖凝胶电泳染色法:

  取扩增产物10μl点样于2%琼脂糖凝胶中, 70V电泳15-20min,溴化乙锭染色5min,于紫外灯下观察结果,在溴酚兰后面有一条,或二条亮红条带为阳性结果, HSV-2带在前,HSV-1带在后,无带则为阴性结果。

  ② Southern印迹法:

  PCR产物20μl 经电泳分离后,用变性液处理60min,再用中和液处理90min,转移至硝酸纤维素膜上,80℃烤膜2h,42℃预杂交(杂交液中)30min,加入32P标记HSV探针后,42℃杂交过夜,次日用1%SDS/PBS pH7。2,42℃洗15min,0.5%SDS/PBS pH7.2,42℃洗15min;膜置X线暗盒内,放射性自显影12-15h,显影为阳性,不显影为阴性。

  (三)、聚合酶链反应—酶谱法(polymerase chain reaction-endonuclease cleavage PCR-EC)

  具有经济广泛等特点;不仅能一次性分型检测HSV-1,HSV-2,EBV,CMV四种病毒,而且方法本身快速、方便、无放射线损伤,易被实验室接受。可检出3个CFU的HSV1,灵敏度高,能检测出中枢神经系统感染第1dCSF中HSV DNA阳性结果,并可用于药物治疗效果的评价。由于病毒的变异性,会出现酶切点突变丢失现象,从而造成酶切阴性结果。对此可以通过型特异性探针或序列分析解决。

  1. 标本处理

  (1)标本采集,方法同上。

  (2)DNA模板制备:每份标本取200μl,按200μg/ml加入蛋白酶k,56℃作用1h;

  加入等体积的酚—氯仿(v/v)轻摇10min,离心1000r/min×5min;取水相加入500μl(2.5倍体积)无水乙醇,-20℃过夜沉淀DNA,离心15000r/min×5min,吸去液体,30℃干燥后,加蒸馏水25μl溶解, 待检。

  2. 引物设计:

  P1,5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′

  P2,5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′

  (1)PCR实验体系:

  反应体积100μl; 模板10μl ; P1 0.5μl(10pmol/L) ,P2 0.5μl(10pmol/L); 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L); 10×缓冲液10μl, DMSD 5μl, DW 65μl, 循环参数为94℃60s; 60℃60s; 72℃60s;循环40次72℃延伸4min。

  (2)扩增产物检测与酶切分型。

  ①第一步电泳鉴定: 取10μlPCR产物加4μl样品缓冲液,加入2%琼脂糖凝胶板,70V电泳(5-20min)加EB染色5min后,紫外灯下观察,可初步鉴定扩增产物大小。

  ②酶切分析:分别取20μlPCR产物于2个Eppendorf管中,加入50μl无水乙醇,-20℃沉淀DNA,再分别用20μlSmal和BamHI反应缓冲液溶解,加入SmaI或BamHI 50U于相应Eppendorf 管内,37℃作用1h。

  ③第二步电泳分型,取10μlPCR酶切物加4μl样品缓冲液,加到2%琼脂糖凝胶中,70V电泳,15-20min后, EB染色5min,与同步加入未酶切的PCR产物相对照。 紫外灯下观察, 结果如下:

  PCR-EC法检测四种病毒结果

  病毒型号靶片段SmaIBamHI

  HSV1518bp476bp+42bp

  HSV2518bp—225+293bp

  EBV524bp100bp+424bp277bp+247bp

  CMV589bp不需酶切,第一步电泳就可以区分

  (四)用RT-PCR检测单纯疱疹病毒

  RNA的聚合酶链反应(RNA-PCR),可能通过检测HSV不同期的RNA,这不仅可诊断HSV感染,而且有利于HSV的潜伏期感染机制的深入研究。

  RT-PCR是以RNA为模板经逆转录反应(RT)产生cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增以达到检测目的。因此,RNA-PCR也可称为RT-PCR。

  1、标本处理:

  组织块细胞总RNA提取,取100mg组织标本,加1ml硫氰酸胍变性液,于匀浆器中,室温研磨均匀后,移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc, 1ml水饱和酚和0.2ml氯仿一异戊醇混匀, 用力振摇10s, 置冰浴15min。10000g4℃,离心20min,取上清水相(上层DNA、下层DNA和变性蛋白质)加入等体积异丙醇置-20℃1h, 沉淀RNA。离心 15000r/min×10min,弃上清, RNA重新用0.3ml硫氰酸胍变性液溶解, 再加0.3ml异丙醇沉淀, -20℃1h, 沉淀RNA. 离心15000r/min×10min, 去上清, 沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次, 真空干燥……加10μl TE缓冲液(pH7.4)溶解,低温保存备用。临用前冰浴溶解。

  2、PCR扩增:

  (1)引物设计: 选择HSV-1ICPO基因(极早期)为检测靶基因。设计2个引物,

  P1 5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′

  P2 5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以扩增ICPO 中266bp序列。

  1个探针:5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。

  (2)PCR实验体系: 总反应体积为50μl,模板10μl (0.25-1.0μg)P1 1μl (20pmol/L);P2 1μl (20pmol/L); 4×dNTP 4μl(200μmol/L); 10×缓冲液5μl; AMV(逆转录酶) 2μl (50U); DW 26μl; 循环参数, 94℃变性2min后 94℃50s,60℃60, 72℃60s,循环40次后72℃延伸5min。

  3、扩增产物的鉴定:

  (1)琼脂糖凝胶电泳染色法:取10μl PCR扩增产物加4μl 样品缓冲液,混匀后加样2%琼脂糖凝胶板,70V电泳15-20min,EB染色5min。紫外灯下观察扩增条带。

  (2)Southern印迹杂交法:用32P标记的特异性探针检测PCR产物,方法同上。

  总之,在HSV感染性疾病的临床诊断中,PCR能对前病毒或潜伏期低复制的HSV特异性靶DNA片段进行扩增检测,远较DNA探针敏感,并能在血清中抗体出现前就可以检出。因此,PCR无论是作为基础研究手段,还是作为临床检验诊断方法,均具有广阔的前景。

  五、病理组织学诊断

  细胞内水肿,基底层形成大水疱,病灶周围有多核巨细胞浸润,特别是多核白细胞与淋巴细胞充斥于病灶中间。

  1.原发性GH

  (1)潜伏期:为2~7天,常为3~5天。

  (2)好发部位:男性多发生于龟头、冠状沟、尿道口、阴茎体及阴囊。女性好发于外阴、阴道及宫颈。两性均可见于肛周、大腿及臀部。

  (3)皮损形态及演变:患处先有烧灼感,随即出现多个群集的红色斑丘疹,并迅速变成小水疱。疱液起初清亮,以后渐变为脓性。水疱易破溃,形成糜烂或浅溃疡,伴明显疼痛。之后结痂而愈,病程约2~4周。

  (4)全身症状:发病前或发病时可有全身症状,如发热、头痛、全身不适、颈项强直和骶2~4段感觉异常,或有排尿困难和白带增多。几乎所有患者均可伴腹股沟淋巴结肿大及压痛。

  2.复发性GH

  约在原发性GH痊愈后1~4个月发生。首次HSV-2感染后1年内近60%的患者复发,第1年内可复发4~6次,以后复发次数减少。eves等发现在生殖器感染者中,HSV-1感染者复发率为14%,而HSV-2感染者则有60%复发。

  复发性GH患者可有上述激发因素,或有前驱症状,全身症状较轻,复发部位多在原处,病程也较短,皮损约经10天左右即消退。由于病损反复发作,难以控制,患者易出现精神负担和性功能障碍,甚至发生抑郁症等。但其损害与原发性者甚为相似。

  3.特殊型GH

  (1)男性同性恋者GH:本病仅次于淋球菌引起的肛门直肠炎。有人从62例有肛门直肠症状但淋球菌检查阴性的男性同性恋者中,29%检出了HSV-2。临床表现多为严重的肛门、直肠疼痛,其他症状为便秘、肛门内有分泌物、里急后重和发热等。部分病人肛周有水疱或溃疡。

  (2)孕妇和新生儿GH:孕妇患GH后,其后果严重。对妊娠GH患者HSV-2携带者来说,最重要的是传染给新生儿。当产道内存在HSV-2时,可有40%~60%的新生儿遭受感染,感染严重者可致死亡。

  在妊娠早期,患GH的孕妇可影响胎儿,导致流产或死胎。新生儿的先天性感染,出生时可出现带状分布的疱疹、癫痫发作、出血倾向与肝脾肿大。如通过产道感染或胎膜早破而发生逆行感染时,轻者出生后数日至数周可无临床症状,早期可仅有吃奶较差、兴奋,以后可发生病毒血症或疱疹性脑炎,重者发生播散性HSV感染,可出现高热、呼吸困难、出血及中枢神经系统病变,预后不良。

  因此,妊娠足月患GH者,如时间允许,应每周从阴道及子宫颈取材,检查有无病毒感染,若细胞学或病毒培养阳性而羊膜尚完整,或破裂后不足6h,建议剖宫产,以避免胎儿经阴道分娩而发生新生儿HSV感染。

  HSV-2感染与宫颈癌:有证据表明,生殖器HSV-2感染可能与宫颈癌的发生有关。血清流行病学检查发现,宫颈癌患者血清中抗HSV-2抗体较对照组妇女明显增高。Nahmias等发现,GH患者发生宫颈非典型增生者为对照组的2倍,而发生原位癌者则为对照组的8倍。近年来研究证明,患侵袭性宫颈癌和癌前期病变的妇女宫颈脱落细胞中,HSV-2抗原阳性率明显高于对照组,这种HSV-2抗原位于肿瘤细胞的胞质内,提示为肿瘤细胞表达的病毒抗原。有人发现,宫颈有高度非典型增生、原位癌及鳞状细胞癌者的活检组织中,用间接免疫荧光染色可发现其中的HSV-2抗原。应用DNA-RNA原位杂交技术在宫颈癌和癌前期组织中67%可发现HSV-2特异性mRNA。Frenkel等在宫颈癌组织中检出HSV-2的DNA。还有作者从手术切除后经放射的宫颈癌病变组织中分离出了HSV-2。

  HSV-2感染与HIV感染 与其他生殖器溃疡性疾病一样,GH增加了HIV感染的危险性。HSV感染是HIV感染的辅助因子。在HIV感染者尤其是HIV感染的同性恋者中,HSV-2感染率更高,且GH的并发症多而严重。在AIDS患者中,耐阿昔洛韦(无环鸟苷)的HSV毒株感染多见。

  根据病史、症状和皮肤或黏膜表现,一般不难作出诊断。必要时可进行实验室检查,以明确病原体。

  中医病机和辨证 本病多因体内蕴热,外感毒邪,热毒相结,肝胆二经湿热下注而生;或因肌肤虚弱,邪毒留肤,遇热即发。

  中医辨证分型

  1.湿热下注型

  主证:患处水疱、糜烂、痒痛交作,大便秘结,小便短赤。舌红,苔黄腻,脉弦滑数。

  辨证:湿热下注,外感毒邪。

  2.肝肾亏损型

  主证:病情反复发作,兼有心烦寐少,腰酸头昏,食少乏味,口干咽燥。舌质淡,脉沉细。

  辨证:清热化湿,养肝滋肾。

  鉴别

  主要与硬下疳,软下疳鉴别:硬下疳为单个质硬的溃疡,无疼痛感,无复发史,实验检查USR(+)或RPR(+),梅毒螺旋体可见。软下疳为质软的溃疡,局部虽有疼痛感但无复发史,实验检查链杆菌阳性。

  1.固定型药疹 有药物过敏史,发疹前有用药史,每次发病位固定且不限于外阴部,其他的皮肤、黏膜交界处也有损害,皮损主要为暗红斑上有厚壁水疱或大疱。

  2.Behcet综合征 可首先出现口腔或外生殖器溃疡,针刺试验阳性,以后可伴虹膜睫状体炎及四肢结节性红斑。

  3.梅毒硬下疳 潜伏期2~4周,局部硬结、溃疡,无自觉症状,苍白螺旋体和梅毒血清反应阳性。

  4.软下疳 发病前2~5天有性乱史,损害为外阴部溃疡,基底软,伴疼痛与触痛,单侧腹股沟淋巴结肿大、触痛,可形成溃疡并排脓,可检出Ducrey嗜血杆菌。

  其他生殖器部位皮肤病如接触性带状疱疹、白塞病。脓疱病有时与生殖器疱疹相似,可以从病史及检查方面相区别。

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